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荧光原位杂交技术(FISH)
发布时间:2022-06-22

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术问世于20世纪70年代后期,是在原来的同位素原位杂交技术基础上发展起来的,是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核酸序列位置的方法。

       荧光原位杂交技术基本原理是,按照两个核酸的碱基序列互补原则,用特殊修饰的核苷酸分子标记DNA探针,然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA 纤维切片上,再与荧光素分子偶联的单克隆抗体和探针分子特异性结合,经荧光检测系统和图形分析技术对染色体或DNA纤维上的DNA序列定位、定性和相对定量。该技术具有快速,安全,灵敏度高以及探针可长期保存等特点,目前已广泛应用于细胞遗传学,肿瘤生物学,基因定位,基因作图,基因扩增及分子诊断等领域。
       荧光原位杂交的优势
       1.试剂和探针无放射性,安全可控;
       2.探针稳定,可长期保存;
       3.特异性好,实验准确。
       4.FISH可定位长度在1kb的DNA序列,其灵敏度与放射性探针相当;
       5.多色FISH通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;
       6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化,也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。
       实验流程
       FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。
       实验操作
       1.设计探针要根据实验的需要来进行,也就是说你要检测的目的基因决定你的探针设计。
       2.组织切片4~5μm 厚,过厚或过薄的切片均会对信号的强弱产生影响,而且切片应完整,质量良好,否则会在预处理时掉片。载玻片的选择建议使用防脱载玻片,有条件的实验室可使用更好的阳离子或者阴离子专用载玻片,可有效防止脱片现象的发生。
       3.标本的处理也是关系到最后信号强弱的关键,但有些人不注意这些细节,结果造成荧光信号弱,难以分辨。这与预处理不当造成探针难以达到饱和而杂交难以进行有关。
       4.这一步是FISH关键中的关键。变性包括标本变性和探针变性,这两个步骤关系到FISH的成败,千万要严格按照操作规程进行,不但如此,特殊标本还要自己摸条件。
       5.操作荧光抗体的时候千万要避光,否则将前功尽弃啊。在FISH,就是使用荧光显微镜观察和记录结果。在正常情况下,目前商业化的探针即使是杂交以后,荧光信号能保存半年之久。有时候,信号也会急剧衰减,几分钟后就不见了。出现这种情况,就是由于没有严格避光。因此在观察和记录的时候,要尽可能地在暗室里面操作。

       结果交付
      1. 原始杂交显色拍照结果图片
      2. 杂交后的切片,剩余探针等实验材料
      3. 完整的实验报告,包括实验过程、所用仪器试剂、蜡块玻片和相关分析数据



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